Che cos'è una reazione a catena della polimerasi (pcr)? fatti su test, passaggi e usati per

Che cos'è la PCR (reazione a catena della polimerasi)?

La reazione a catena della polimerasi (PCR) è una tecnica che viene utilizzata per amplificare tracce di DNA (e in alcuni casi, RNA) situato in o su quasi tutti i liquidi o superfici in cui possono essere depositati filamenti di DNA. La chiave per comprendere la PCR è sapere che ogni essere umano, animale, pianta, parassita, batterio o virus contiene materiale genetico come sequenze di DNA (o RNA) (sequenze di nucleotidi o pezzi di DNA o RNA) che sono uniche per la loro specie, e al singolo membro di quella specie. Di conseguenza, se un campione contiene segmenti di DNA o RNA, la PCR è un metodo utilizzato per amplificare (fare molte copie più identiche) di queste sequenze uniche in modo che possano quindi essere utilizzate per determinare con un'altissima probabilità l'identità della fonte (a persona specifica, animale o organismo patogeno) del DNA traccia o RNA trovato in o su quasi ogni campione di materiale.

L'amplificazione della PCR è tuttavia solo una parte del test di identificazione. Una volta eseguita l'amplificazione (vedi sotto), i segmenti amplificati devono essere confrontati con altri segmenti nucleotidici da una fonte nota (ad esempio una persona specifica, un animale o un organismo patogeno). Questo confronto di segmenti unici viene spesso effettuato posizionando sequenze nucleotidiche generate dalla PCR accanto a sequenze nucleotidiche note di esseri umani, agenti patogeni o altre fonti in un gel separatore. La corrente elettrica attraversa il gel e le varie sequenze di nucleotidi formano bande che assomigliano a una "scala" in base alla loro carica elettrica e dimensione molecolare. Questo è chiamato elettroforesi su gel. Bande o "scale" come passaggi che migrano agli stessi livelli nel gel mostrano l'identità delle sequenze di nucleotidi. Questo metodo è uno dei metodi più popolari per completare i test PCR (vedere la figura 1).

Figura 1, Fasce o "scala" come passaggi della PCR hanno prodotto DNA di Mycobacterium (per gentile concessione del CDC)

Figura. Schemi di elementi ripetitivi (Rep) –PCR (A) e di elettroforesi su gel a campo pulsato (PFGE) (B) di isolati di Mycobacterium cosmeticum da 2 pazienti in Ohio e 1 paziente in Venezuela. La rep-PCR è stata eseguita utilizzando il primer BOXA1R (3) e la PFGE è stata eseguita con l'enzima di restrizione AseI. Corsie 1, 2, Ohio isola OH1 e OH2; corsie 3, 4, ceppi di controllo ATCC BAA-878T e ATCC BAA-879; corsia 5, isolato venezuelano VZ1. Gli standard delle dimensioni del DNA sono 100-bp (S1) e 48, 5 kb (S2).

Come viene eseguita la PCR (reazione a catena della polimerasi)?

Nel 1983, Kary Mullis ha scoperto i passaggi di base per amplificare le sequenze di DNA. Lui e Michael Smith hanno ricevuto il premio Nobel per lo sviluppo di questa procedura nel 1993. Ci sono alcuni passaggi di base che vengono seguiti in sequenza; La PCR può essere eseguita in un unico tubo con sostanze chimiche appropriate e un riscaldatore appositamente progettato. I reagenti o i prodotti chimici necessari sono i seguenti:

• Un campione che contiene una sequenza nucleotidica (da sangue, capelli, pus, raschiatura della pelle, ecc.)
• Primer di DNA: breve DNA a singolo filamento che si attacca alle sequenze di nucleotidi che promuove la sintesi di un filamento complementare di nucleotidi
• DNA polimerasi: un enzima che, quando il DNA ha un legame di primer, scende nel segmento del DNA che collega i blocchi di costruzione del DNA per formare coppie di basi complementari e quindi sintetizza un filamento di nucleotidi complementari di DNA (l'introduzione di una DNA polimerasi resistente al calore, Taq la polimerasi, derivata da batteri resistenti al calore, ha notevolmente migliorato la capacità di eseguire la PCR)
• Un grande eccesso di blocchi di DNA chiamati nucleotidi (adenina, timidina, citosina e guanina, abbreviati rispettivamente in A, T, C e G) è presente nella soluzione. Quando questi blocchi sono collegati insieme, formano una sequenza nucleotidica o un singolo filamento di DNA. Quando questi elementi costitutivi legano il loro elemento costitutivo complementare con legami idrogeno deboli (ad esempio, A legherà solo con T e G solo con C) si forma una sequenza nucleotidica di DNA complementare che si lega al DNA originale a singolo filamento. Quando il legame è completato, si forma un DNA complementare a doppio filamento in una sequenza specifica.

La PCR, quindi, inizia con un segmento di DNA da un campione che viene posto in una provetta con i reagenti sopra elencati. La soluzione viene riscaldata ad almeno 94 C (201.2 F); questo calore rompe i legami idrogeno che consentono la formazione di filamenti di DNA complementari, quindi nella miscela esistono solo filamenti singoli (questo è chiamato denaturazione del DNA a doppio filamento).

Si lascia raffreddare la miscela a circa 54 ° C (129, 2 ° F). A questa temperatura, i primer di DNA e la DNA polimerasi si legano al singolo DNA a singolo filamento (questo è chiamato ricottura del DNA). Poiché i mattoni sono in eccesso (alta concentrazione) nella miscela, la polimerasi li utilizza per creare nuovi filamenti complementari di DNA (definito estensione del DNA) e questo processo è più rapido a 72 ° C (161, 6 ° F). Questo processo crea una nuova molecola di DNA a doppio filamento da ciascuno dei singoli filamenti della molecola originale.

Questo ciclo viene ripetuto circa 40 volte in una macchina denominata termociclatore che ripete automaticamente i cicli di riscaldamento-raffreddamento, con la quantità di ciascuna sequenza di DNA che raddoppia ogni volta che il ciclo di riscaldamento-raffreddamento viene completato. Quello che inizialmente era un singolo segmento corto di DNA può essere amplificato a circa 100 miliardi di copie dopo 40 cicli di raddoppio.

Perché un medico dovrebbe ordinare un test PCR (reazione a catena della polimerasi)?

Il test PCR costituisce la base di una serie di test che possono rispondere a molte diverse domande mediche che aiutano i medici a diagnosticare e curare i pazienti. Ad esempio, i test PCR possono rilevare e identificare organismi patogeni nei pazienti, in particolare quelli che sono difficili da coltivare (ad esempio, l'HIV e altri virus e alcuni funghi).

Altri medici ordinano test PCR per aiutare a diagnosticare le malattie genetiche, mentre altri medici usano PCR per rilevare relazioni biologiche come l'identificazione dei genitori di bambini. I test PCR vengono anche utilizzati per identificare e caratterizzare mutazioni genetiche e riarrangiamenti riscontrati in alcuni tumori.

Tuttavia, i test PCR sono stati modificati ed estesi in molti aspetti delle indagini scientifiche tra cui la biologia evolutiva, l'impronta digitale genetica, le indagini forensi e molti altri.

Che cos'è RT-PCR?

RT-PCR è un test PCR progettato per rilevare e misurare l'RNA. Sebbene i test PCR iniziali abbiano amplificato il DNA, molti virus e altri componenti biologici (ad esempio i mitocondri) utilizzano l'RNA come materiale genetico. RT-PCR differisce dalla PCR convenzionale prendendo prima l'RNA e convertendo il filamento di RNA in un filamento di DNA. Questo viene fatto essenzialmente con lo stesso metodo per PCR descritto sopra, ad eccezione dell'uso di un enzima chiamato trascrittasi inversa invece della DNA polimerasi. La trascrittasi inversa consente di tradurre un singolo filamento di RNA in un filamento complementare di DNA. Una volta che si verifica quella reazione, il metodo di PCR di routine può quindi essere utilizzato per amplificare il DNA. RT-PCR è stato utilizzato per rilevare e studiare molti virus RNA.

RT-PCR non deve essere confuso con un'altra variazione di PCR, chiamata PCR in tempo reale. Real-Time PCR è una variante della PCR che consente l'analisi del DNA amplificato durante i soliti 40 cicli della procedura. Sebbene la procedura sia simile alla PCR convenzionale con il ciclismo, la PCR in tempo reale utilizza coloranti fluorescenti collegati ad alcuni dei blocchi costitutivi o piccoli fili di nucleotidi. A seconda del metodo utilizzato, la fluorescenza si verifica quando si formano i filamenti di DNA amplificati. La quantità di fluorescenza può essere misurata durante i 40 cicli e consente agli investigatori di misurare prodotti specifici e le loro quantità durante i cicli di amplificazione. Ciò consente spesso agli investigatori o ai tecnici di laboratorio di saltare l'elettroforesi su gel o altre procedure secondarie necessarie per l'analisi dei prodotti della PCR, producendo così risultati più rapidi.

Real-Time PCR e RT-PCR sono variazioni o modifiche del test PCR originale. Tuttavia, esistono molte più varianti (almeno 25) che esistono e vengono utilizzate per risolvere problemi specifici. Hanno tutti nomi diversi come Assembly PCR, Hot-start PCR, Multiplex PCR, Solid-phase PCR e molti altri.

È probabile che la PCR continui a essere modificata per aiutare a rispondere a qualsiasi altra domanda in medicina, in biologia. e altri campi di studio.